Prionen

 BSE, Creutzfeld-Jakob Krankheit, Scrapie und ähnliche neurodegenerative Krankheiten, die inzwischen ein ernstes gesundheitliches und volkswirtschaftliches Problem darstellen, lassen sich in der Gruppe der Prionenkrankheiten zusammenfassen, so genannt nach der pathogenen Form eines Proteins (PrP), dessen Auftreten ein charakteristisches Merkmal dieser Krankheiten ist. Der Mechanismus der Prionenerkrankungen ist bis heute nicht genau verstanden. Unser Ziel ist daher, die molekulare Grundlage von Prionenerkrankungen durch die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) zu untersuchen. Obwohl die bislang durchgeführten Untersuchungen noch keine klaren Aussagen über die Infektionsmechanismen bei Prionenerkrankungen zulassen, sprechen vor allem die Resultate der Experimente mit Knock-out-Mäusen (Weissmann 1996) für eine enge Korrelation zwischen Infektiosität und der Wechselwirkung zwischen zellulärem (PrPC) und Scrapie-assoziiertem (PrPSc) Prionprotein: das Vorhandensein des PrPC ist eine notwendige Voraussetzung für Neurotoxizität des PrPSc und für die Ausbreitung der Krankheit. Eine grundsätzliche Fragestellung hinsichtlich der Aufklärung des Infektionsmechanismus auf Proteinebene besteht darin, ob die zu beobachtende Aggregation von PrPSc, die im Extremfall zur Bildung von beta-Amyloid-Plaques führt, notwendige Bedingung oder Folge von Strukturumwandlung, Resistenz des Proteins gegen Proteinase-K-Verdau sowie letztlich von Infektiosität überhaupt darstellt. In anderen Worten: welche Kausalbeziehung läßt sich zwischen diesen korrelierten Phänomenen zeigen, worin besteht der erste Schritt bei der Infektion? Darüber müßte eine physikalisch-chemische Analyse der Wechselwirkungen zwischen PrPC und PrPSc auf der Grundlage der Prion-Hypothese, insbesondere bei extrem niedrigen Konzentrationsverhältnissen, wesentliche Aufschlüsse liefern. Verschiedene mögliche Infektionsmechanismen wurden, basierend auf der Prion-Hypothese, von Eigen 1996 umfassend theoretisch behandelt. Dabei zeigte sich, daß die Bildung von Aggregaten ein zumindest notwendiger Schritt bei der Umwandlung von Prionprotein in die pathogene Form ist.

Um die Spezifität der postulierten posttranslationalen Modifikation und damit auch den initialen Schritt des Einbaus von PrP in Aggregate besser verstehen zu können, liegt es nahe, die Wechselwirkung zwischen PrPSc und unterschiedlichen Spezies von PrPC auf möglichst niedermolekularer Ebene physikalisch-chemisch zu untersuchen. Der Einfluß von Punktmutationen, Glykosylierung und anderer Modifikationen des Prionproteins kann bewertet werden. Daran anknüpfend soll die Wechselwirkung zwischen PrPC und PrPSc verglichen werden. Untersuchungen mit unterschiedlichen PrP-Spezies eröffnen die Perspektive, die Speziesbarriere zwischen Prionen quantitativ zu erfassen.

FCS in der von uns angewandten konfokalen Variante erlaubt eine ultrasensitive Messung von Bindungs- und Aggregationsprozessen fluoreszenzmarkierter Moleküle in Lösung und in Membranen in nano- bis subpicomolaren Konzentrationen. Dabei befindet sich im Meßvolumen von ~1 Femtoliter im zeitlichen Mittel weniger als ein Molekül, d.h. es ist prinzipiell möglich, Wechselwirkungen von einzelnen Proteinmolekülen zu untersuchen.

Diese hochempfindliche Meßmethode soll schließlich die Grundlage für ein höchst sensitives diagnostisches Verfahren zum Nachweis von Infektiosität bilden, das in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Riesner in Düsseldorf entwickelt wird. Mit ihr läßt sich die Aggregatbildung, die nach theoretischen Arbeiten von Eigen und praktischen Arbeiten von Riesner charakteristisch für eine Prioneninfektion ist, prinzipiell auf Einzelmolekülebene nachweisen.

Göttinger Wissenschaftler haben ein neuartiges hochempfindliches Verfahren zum Nachweis von Prionen entwickelt. Prionen sind Erreger der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit und der Rinderseuche BSE. Mit der Göttinger Methode können jetzt einzelne Erregerpartikel in Körperflüssigkeiten direkt sichtbar gemacht werden. So konnten erstmals Prionen in der Rückenmarksflüssigkeit von Creutzfeldt-Jakob- Patienten nachgewiesen werden.

Prionen besitzen kein nachweisbares Erbgut. Sie bestehen aus einer krankhaften, verklumpten Form eines bestimmten körpereigenen Eiweißes, des Prionproteins. Krankhafte Protein-Ablagerungen konnten bisher meist erst nach dem Tod der Patienten im Gehirngewebe nachgewiesen werden. Dies ist künftig auch in der leichter zugänglichen Rückenmarksflüssigkeit möglich. Das Testverfahren beruht auf der so genannten konfokalen Zweifarben-Fluoreszenz-Kreuzkorrelations-Spektroskopie. Ein gebündelter Laserstrahlweist dabei einzelne mit Farbstoffen markierte Moleküle nach. Den Göttinger Wissenschaftlern gelang es mit Hilfe von spezifischen Antikörpersonden, Prionpartikel entsprechend zu markieren. Die einzelnen markierten Partikel konnten dann mit einem Laserstrahl, der ähnlich einem Suchscheinwerfer funktioniert, aufgespürt werden (scanning for intensely fluorescent targets, SIFT).

Mit der neuen Technik lassen sich auch weitere Eiweißpartikel nachweisen, sagen die Forscher. Das Verfahren eigne sich deshalb auch zur frühen Diagnose anderer Krankheiten wie etwa Alzheimer. Bei dem Krankheitserreger der Prionenerkrankungen, dem sogenannten Prion, handelt es sich um eine völlig neue Art von Erreger, der sich von Bakterien und den bis heute bekannten Viren in wesentlichen Punkten unterscheidet: Prionen sind extrem resistent gegen Hitze und Chemikalien. Selbst Erhitzen auf 100°C kann Prionen nicht inaktivieren, und viele der gebräuchlichen Desinfektionsmittel zeigen kaum Wirkung. Prionen sind auch nur sehr schwer biologisch abbaubar - in der Erde überleben sie über Jahre hinweg.

Im infizierten Gehirn lässt sich ein Protein identifizieren, welches spezifisch nur bei Prionenerkrankungen beobachtet wird. Dieses Protein, das "Scrapie Prionprotein", kurz PrPSc (bei BSE auch PrPBSE genannt), ist eine abgewandelte Form des im normalen Körper vorkommenden Prionproteins PrPC.

Die beiden Proteine, das krankheitsspezifische PrPSc und das normale PrPC unterscheiden sich durch ihre unterschiedliche räumliche Struktur. Ein weiterer Unterschied besteht darin, dass PrPSc resistent ist gegen den Abbau durch Verdauungsenzyme (Verdauungsenzyme sind Proteine die z.B. im menschlichen Magen die Nahrung verdauen), während PrPC durch Behandlung mit Verdauungsenzymen vollständig zerstört wird.

Während des Krankheitsverlaufs nimmt die Menge an PrPSc im Körper zu. Diese Zunahme an PrPSc korreliert mit der Zunahme von Infektiosität. Auf Grund vieler Studien ist die Wissenschaft heute zur Schlussfolgerung gekommen, dass PrPSc ein Bestandteil des Prions, des Krankheitserregers der Prionenerkrankungen ist. Man spekuliert sogar, dass PrPSc selbst den ganzen Erreger darstellt. Nach dieser Theorie bewirkt bei einer Infektion das eindringende PrPSc eine Umwandlung von PrPC in PrPSc (Siehe untenstehende Grafik). Das neu entstandene PrPSc kann nun seinerseits die Umwandlung von mehr PrPC in PrPSc bewirken. Dies führt zu einer verhängnisvollen Kettenreaktion, bei der die PrPSc Produktion exponentiell ansteigt und das Gehirn durch die PrPSc-Ablagerungen unwiderruflich geschädigt wird.

Intakte Prionen, deren krankhafte Abart die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit auslösen, spielen in gesunden Hirnzellen eine wichtige Rolle. Französische Wissenschaftler fanden heraus, dass das Protein an der Feinregulierung von Nervenzellen beteiligt ist. Das schreiben die Forscher im amerikanischen Fachblatt "Science" (Band 289, Nr. 5486, S. 1925). Bislang war weitgehend unbekannt, welche Aufgaben die intakten Prionen im Hirn von Mensch und Tier haben.

Nach Angaben des Teams um Odile Kellermann vom Institut Pasteur in Paris findet sich das Protein vor allem an der Oberfläche von den Ausläufern der Nervenzellen. Diese Fortsätze empfangen und verarbeiten die elektrischen Signale ihrer Nachbarn. Die Forscher berichten jetzt, dass die intakten Prionen auf ein äußeres Signal hin das Fyn-Enzym in den Nervenzellen aktivieren. Fyn könne seinerseits zahlreiche Vorgänge in den Nervenzellen auslösen. Die Prionen seien mithin Teil einer bedeutenden Regulationskaskade.

Beim Rinderwahnsinn und der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit ändern die Prionen ihre Form, verklumpen und lagern sich schließlich in großer Zahl im Hirn ab. Gedächtnisschwäche, Demenz und Tod sind die Folge. Die normalen Prionen von Rindern und Menschen haben eine sehr ähnliche Struktur. Krankhaft veränderte Rinderprionen können nach Meinung von Wissenschaftlern im Gehirn von Menschen gesunde Prionen zu kranken umformen. Das französische Team will die jetzt in Mäusezellen entdecke Signalkaskade noch besser untersuchen. Möglicherweise ergebe sich daraus eine Strategie, mit der sich den tödlichen Krankheiten vorbeugen ließe.

TSE-Erreger geben den Mikrobiologen nach wie vor Rätsel auf. Daß es sich um wahrhaft 'unkonventionelle' Erreger handelt, zeigt schon ein Blick auf ihre beispiellos hohe Stabilität. Nur konzentrierte Säuren oder Laugen und chlorhaltige Lösungen inaktivieren sie zuverlässig. Dagegen sind herkömmliche formaldehyd- oder alkohol-haltige Desinfektionsmittel völlig wirkungslos. TSE-Erreger widerstehen ultravioletter oder ionisierender Strahlung, die bei Viren durch die Schädigung des Erbguts zu einer völligen Zerstörung ihrer Infektiosität führen. Aufgrund dieser Eigenschaften vermutete der amerikanische Mikrobiologe Griffith 1967, daß es sich bei diesen Erregern um reine Proteine, also um Eiweiße, handeln könnte. Der Amerikaner Prusiner griff diesen Gedanken Ende der siebziger Jahre auf und formulierte im Jahre 1982 die Grundlagen der Prion-Theorie. Sie geht davon aus, daß ein krankhaft verändertes Eiweiß, das Prion-Protein, den Infektionserreger darstellt, was eine grundlegend neue Klasse von Infektionserregern postuliert (Viren besitzen immerhin neben einer Eiweißhülle auch noch eine darinliegende Erbsubstanz, die Nukleinsäuren DNS oder RNS). Der eindeutige Beweis für diese Theorie steht allerdings noch aus. Daneben wird weiterhin diskutiert, daß ein Virus für diese Erkrankungen verantwortlich sein könnte, welches das Prion-Protein nur als Rezeptor zum Eindringen in die Zelle benutzt. Anhänger der Virino-Theorie postulieren dagegen, daß eine kleine virale Nukleinsäure nicht von viruseigenen Proteinen, sondern von Prion-Protein umgeben ist. Bisher gelang es aber nicht, eine solche erregerspezifische Nukleinsäure nachzuweisen.

Ein natürlicher Bestandteil des Körpers
Eines der zahlreichen Proteine, die natürlicherweise in den Hirnzellen von Menschen und Wirbeltieren vorkommen, ist das sogenannte Prion-Protein (PrPC). Schon früh wurde gezeigt, daß im Gehirn erkrankter Personen und Tiere eine veränderte Form dieses Proteins auftritt, die immer mit dem Vorhandensein des infektiösen Agens korreliert. Diese Form wird als pathologisches Prion-Protein (PrPSc) bezeichnet. Die Funktion des Prion-Proteins ist bis heute unklar: Transgene Mäuse, die nicht mehr in der Lage sind, das zelluläre PrPC zu bilden (PrP0/0-Mäuse), entwickeln sich völlig normal. Möglicherweise spielt PrPC bei der Regulation der inneren Uhr oder bei der Nervenreizleitung in Synapsen eine Rolle. Das Gen für das Prion-Protein liegt im Erbgut bei Mensch und Tier jeweils nur einmal je Chromosomensatz vor. Das Protein besteht - je nach Spezies - aus 254 bis 273 Aminosäuren. Bei seiner Bildung in der Zelle wird es mit unterschiedlichen Mengen von Zuckerresten verknüpft. Reifes Prion-Protein weist daher drei verschiedene Molekularmassen auf, die sich in biochemisch-immunologischen Nachweisverfahren als charakteristische Banden darstellen lassen.

Das pathologische Prion-Protein
Umformung des zellulären Prion-Proteins (grün) in seine pathologische Form (rot). Pathologisches Prion-Protein lagert sich an zelluläres Prion-Protein an und bildet mit ihm einen Intermediär-Komplex, aus dem zwei pathologische Prion-Protein-Moleküle hervorgehen. Nach der Prion-Theorie stellt die Umwandlung vom natürlichen zellulären Prion- Protein (PrPC) zum pathologischen Prion-Protein (PrPSc) das Schlüsselereignis für die Vermehrung des infektiösen Agens dar (Abb. 3). Wie diese Umwandlung im Einzelnen im Organismus vonstatten geht, ist bislang noch nicht geklärt. Immun-histochemischer Nachweis der Ablagerung von pathologischem Prion-Protein im Gehirn einer an Scrapie erkrankten Maus. Die pathologischen Prion-Proteine wurden markiert und angefärbt: Sie sind in den befallenen Zellen als rote, kleinkörnige Ablagerungen zu erkennen. Anders als PrPC liegen PrPSc als intrazellulär abgelagerte Aggregate vor. Die Proteine besitzen eine partielle Resistenz gegenüber dem eiweißabbauenden Enzym Proteinase-K: Nur das erste Drittel der Aminosäurekette wird enzymatisch verdaut. Der Nachweis der Anreicherung des resistenten Reststücks im Gehirn besitzt diagnostische Bedeutung. Gegen zelluläres wie auch pathologisches Prion-Protein bildet das Immunsystem aufgrund der natürlichen Toleranz gegenüber körpereigenen Bestandteilen keine Antikörper. Deshalb ist derzeit keine Serodiagnostik für diese Erkrankungen möglich. Immunoblot-Nachweis des pathologischen Prion-Proteins (PrPSc) im Gehirn eines an BSE verendeten Rindes. PrPSc wurde gereinigt, aufgetrennt und sichtbar gemacht. Die drei charakteristischen Banden sind nur im Gehirnextrakt des BSE-Tieres, nicht aber im Gewebe eines gesunden Rindes nachzuweisen. PrPSc besitzt darüber hinaus eine partielle Proteinase K- (PK) Resistenz: die Behandlung mit dem Enzym führt nicht zum vollständigen Verdau.

Die Pathogenese
Infektionsversuche belegen, daß die Bildung des normalen Prion-Proteins in den Zellen nicht nur eine Voraussetzung für den Ausbruch der Erkrankung darstellt, sondern auch für die Vermehrung der Erreger notwendig ist. Mäuse ohne Prion-Gen erkranken nicht und produzieren auch keine infektiösen Erreger. Wird allerdings das Gen repariert, so bilden diese Tiere wieder Prion-Protein und werden für die Krankheit empfänglich. Implantationsexperimente mit embryonalem Nervengewebe einer PrP-bildenden Maus in das Gehirn einer PrP0/0-Maus erbrachten einen weiteren Einblick in die Pathogenese dieser Erkrankungsgruppe: Nach einer Infektion der so implantierten Mäuse mit Scrapie- Erregern degenerieren ausschließlich die Zellen im implantierten Gewebe und bilden pathologisches PrP, ohne daß die Mäuse erkranken. Inzwischen wurden transgene Mäuse hergestellt, bei denen das PrP-Gen gezielt entweder nur in Nervenzellen oder nur in Astrozyten (Stützzellen des Nervengewebes) gebildet wird. Da beide Maustypen an Scrapie erkranken, sind wohl beide Zellarten infizierbar und vermehren den Scrapie-Errreger. Welcher Mechanismus ursächlich für den Untergang der Zellen verantwortlich ist, ist bisher noch unklar. Ein synthetisches 'Mini-Eiweiß' aus 20 Aminosäuren, das einem Teilstück von PrP entspricht, bringt in der Zellkultur neuronale Zellen von normalen Mäusen zum Absterben, nicht aber die Zellen von PrP0/0-Mäusen. Trotz großer Anstrengungen konnte bisher kein chemischer Unterschied zwischen PrPC und PrPSc gefunden werden. Physikalische Untersuchungen zeigen aber, daß PrPSc vorwiegend aus ß-Faltblatt-Strukturen aufgebaut ist, während PrPC einen höheren Anteil an a-helikalen Strukturen aufweist. Das heißt, beide Erscheinungsformen des Proteins bestehen aus den gleichen Aminosäuren, haben aber eine andere räumliche Struktur. Dies könnte die unterschiedlichen Eigenschaften von PrPSc und PrPC zumindest teilweise erklären.

Die Artbarriere
Die Übertragung von TSEs über verschiedene Tierarten hinweg verläuft im allgemeinen sehr ineffizient. Man spricht hier von einer Artbarriere. So sind Mäuse nur dann mit Hamster-Prionen infizierbar, wenn sie das Hamster-Prion-Protein-Gen tragen. Diese Mäuse bilden dann folgerichtig auch nur pathologisches Hamster-PrPSc und kein Maus-PrPSc. Dabei unterscheiden sich die Hamster- und die Maus-Prion-Proteine nur in wenigen Aminosäuren. Generell wird angenommen, daß die Artbarriere umso niedriger ist, je mehr sich die Prion-Proteine der verschiedenen Arten ähneln. . Ist nun die Prion-Theorie bewiesen?
Die beschriebenen Ergebnisse belegen eine enge Assoziation zwischen Erkrankung, ursächlichem Infektionserreger und Prion-Protein. Sie beweisen allerdings nicht endgültig, daß der Infektionserreger mit dem pathologischen PrP identisch ist. Veränderungen im PrP-Gen, die in bestimmten Familien gefunden werden, haben ein deutlich höheres Auftreten von TSE zur Folge und transgene Mäuse, die solch ein mutiertes menschliches PrP-Gen tragen, erkranken spontan. Zwar war diese Erkrankung auf andere Mäuse übertragbar, es ließ sich aber in deren Gehirn kein pathologisches PrP nachweisen. Den wichtigsten Einwand gegen die Prion-Theorie stellt aber die Beobachtung von TSE-Erregerstämmen dar, die sich durch unterschiedliche Inkubationszeiten sowie durch unterschiedliche Zerstörungsmuster im Gehirn auszeichnen. Es ist unklar, wie diese Stammeseigenschaften von einem einzigen Protein mit einer fest definierten Aminosäuresequenz codiert werden sollten. Deshalb kann bis heute nicht ausgeschlossen werden, daß neben PrP auch andere Faktoren ursächlich an der Krankheit beteiligt sind.

Forschungsprojekte der BFAV
In der Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere (BFAV) werden alle immunochemischen Untersuchungen zur Abklärung begründeter BSE- und Scrapie- Verdachtsfälle in Deutschland durchgeführt. Drei der vier in Deutschland aufgetretenen BSE-Fälle - alle in importierten Rindern aus Großbritannien - und auch die jüngste BSE-Erkrankung des Galloway-Rindes, das im Dezember 1996 im Landkreis Höxter verendete, wurden in der BFAV bestätigt. Diese Tiere stammen alle aus Großbritannien. In einem vom Bundeslandwirtschaftsministerium (BML) geförderten Projekt wurde der Immunoblot-Nachweis des pathologischen PrP von Rind, Schaf und Ziege etabliert und optimiert. Auf der Grundlage dieser Arbeiten sind wir nun bestrebt, Nachweisverfahren zu entwickeln, die auch routinemäßig zur Untersuchung von Proben auf BSE oder Scrapie eingesetzt werden können. Darüber hinaus gelang es in der BFAV erstmals, Infektionserreger auch im peripheren Nervensystem eines an Scrapie erkrankten Schafes nachzuweisen. Weiterhin wird eine transgene Maus entwickelt, die anstelle des eigenen Prion-Proteins das Rinder-Prion-Protein bildet. Bei dieser sollte die ansonsten hohe Artbarriere bei der Übertragung des BSE-Erregers auf die Maus erniedrigt sein, so daß sich diese Tiere zu einem schnelleren und empfindlicheren Nachweis von BSE-Erregern eignen. Im Rahmen eines europäischen Forschungsverbundes werden Zellkultursysteme zur Vermehrung von TSE-Erregern verbessert, daneben beinhaltet ein vom Bundesforschungsministerium (BMBF) gefördertes Vorhaben die Analyse der Struktur des pathologischen Prion-Proteins.